カイネティクス測定キナーゼアッセイ
PhosphoSens™ キット & 基質製品
Mg2+をキレーティングすることで蛍光を発する(Chelation-enhanced fluorescence:CHEF)Sulfonamido-Oxine(Sox) をペプチドなどの基質に結合させ、キナーゼによる基質のリン酸化を蛍光強度の増加として経時的に検出することを可能にした技術がPhosphoSens™ です。この技術を用いることにより、ホモジニアスなアッセイ系で簡便にダイレクトなカイネティックス測定が可能となりました。PhosphoSens™ 技術を用いて既にアッセイが構築されているターゲットを全てお使いやすいキット製品および基質製品としてご提供中です。
キットに含まれている試薬は全て最適化されており、お客様は試薬を混合して測定するだけ。リン酸化および脱リン酸化状態の変化をリアルタイムにモニターできるため、様々なパラメーター解析が可能、Km, Vmax, kcat, IC50, Kinact/KI, Ki, Kon, Koff, Residence Time 等々ご要望に合わせて幅広いデータを取得頂けます。また、一部のターゲットではエンドポイントでの測定を可能にするPhosphosens™ REDにも対応しております。初回キットご購入後は個別PhosphoSens™ 基質製品と試薬セットをお求め頂けば簡便にアッセイのスケールアップを行って頂けます。
PhosphoSens™技術とは？
[ アッセイ原理 ]
PhosphoSens™ ではSoxをシステイン残基に導入した改良型CSoxセンサーを使用。CSoxを結合させた基質がキナーゼ、ATP、Mg2+の存在下でリン酸化されるとMg2+がリン酸基とCSoxにキレーティングされることにより複合体が形成される。ここに励起光を照射することで蛍光を発する。この蛍光強度の変化を経時的に検出することで、基質のリン酸化状態の変化をリアルタイムでモニターすることが出来る。
（本技術はマサチューセッツ工科大学（MIT)にて開発、MITが保持する特許を独占的にAssayQuant社が実施）
＜PhosphoSens™ RED＞
ハイスループットな試験実施にはエンドポイントでの測定が可能なPhosphosens™ REDがお勧めです。
反応系にEuropium(Eu3+)を添加することで、Mg2+の配位が置換され360nmの励起により616-620nmの赤色域の蛍光を発するcomplexが形成されます。complexが発する赤色光を時間分解蛍光測定(100-200 μ seconds delay)で検出することにより、青～緑色領域で強くみられる化合物の自家蛍光などのバックグラウンドの蛍光が排除されます。
Phosphosens™ REDをご利用頂けるターゲットはターゲットリスト上の赤色表示ターゲットとなります。
通常のPhosphosens™カイネティクス測定と同一の基質をご利用頂けるターゲットでは、スループットの高い試験から構造活性相関(SAR)やMechanism of Action(MOA)の解析までシームレスにアッセイ展開を実施頂けます。
測定ステップ
（経時/エンドポイント測定用）
ATP 溶液
DTT 溶液
リアクションバッファー
希釈バッファー
EGTA
ユーロピウム （エンドポイント測定用のみ）
（試薬はセット提供のみ）
DTT 溶液
リアクションバッファー
希釈バッファー
EGTA
ユーロピウム （エンドポイント測定用のみ）
