Carna 利用自有激酶蛋白测定的 ADP-Glo™ 检测条件，为您在实验室采用 ADP-Glo™ 激酶检测系统进行药物评价或筛选检测的建立提供参考数据。

本页面所述检测条件下获得的数据，可于“Sample Activity Data(示例活性数据)”栏下载 PDF 查看。各靶点的 ATP 浓度、金属离子条件、添加剂及反应时间等详细信息均载于对应附件 PDF 中。

• 我们的 ADP-Glo™ 分析操作流程
• ATP酶活性评估的重要性

上述数据所用的全部激酶蛋白、生物素标记肽底物及检测缓冲液，均可直接向 Carna 采购。如需产品咨询、技术答疑或定制服务，请点击此处或发送邮件至 info@carnabio.com 联系我们。

ADP-Glo™ 激酶分析反应条件

我们的 ADP-Glo™ 分析操作流程

• 配制检测缓冲液（20 mM HEPES、0.01% Triton X-100、2 mM DTT，pH 7.5）。
• 用该缓冲液分别配制 4× ATP 溶液、4× 底物/金属溶液（含各激酶反应所需添加剂）以及 4× 激酶溶液。
• 于黑色聚苯乙烯 384 孔微孔板（Corning #3573）每孔依次加入检测缓冲液 5 µL、4× ATP 溶液 5 µL、4× 底物/金属溶液 5 µL 及 4× 激酶溶液 5 µL，室温孵育 1 小时。
• 每孔加入 20 µL ADP-Glo™ 试剂（Promega），孵育 ≥40 min 以终止激酶反应并降解残余 ATP。
• 随后每孔加入 40 µL Kinase Detection Reagent（Promega），继续孵育 ≥40 min，将 ADP 转化为 ATP。
• 使用 EnVision 2104（Revvity）测定各孔化学发光强度，并将发光值换算为 ADP 浓度，以评估激酶活性。

注意：有关详细的实验流程，请参阅 Promega 提供的 ADP-Glo™ 激酶分析技术手册。

ATP酶活性评估的重要性

ATPase 是一类仅利用水（H₂O）作为反应物、无需其他分子组分即可催化 ATP 水解生成 ADP 与无机磷酸（Pi）的酶。Carna 在体外实验中发现，某些激酶即便在无肽底物存在的情况下，亦表现出显著的内在 ATPase 活性，自发生成 ADP。ADP-Glo™ 激酶检测系统会将激酶反应产生的 ADP 重新转化为 ATP，并通过荧光素酶反应定量，最终以化学发光信号呈现。虽然发光强度被用作激酶活性的读数，但由内在 ATPase 活性产生的 ADP 并不依赖于底物存在。因此，在解读 ADP-Glo™ 实验数据时，务必将 ATPase 活性纳入考量。

Carna在上表中提供了我们对高纯度激酶的ATP酶活性观察数据。这些数据可用于了解ATP酶活性在ADP-Glo™分析中的潜在影响。

JNK2 (MAPK9) 的活性是使用 ADP-Glo™ 激酶分析法，以 K252a 为底物进行测量的。
即便在无底物的情况下，随着激酶浓度的升高，RLU 亦呈依赖性增长；而在加入底物后，RLU 虽有进一步升高，但所测得的发光信号主要源于激酶水解 ATP 的 ATPase 活性，而非其特异性磷酸化底物的激酶活性。这表明该激酶的 ATPase 活性显著高于其底物特异性磷酸化活性。

即便采用 ADP-Glo™ 以外的方案测定激酶活性，若所用激酶本身 ATPase 活性较强，也可能导致反应体系中 ATP 降解，进而干扰结果。因此，建议对这类激酶辅以可直接检测底物磷酸化的方法（如迁移率变动分析），以排除 ATP 水解带来的偏差。

JNK2（MAPK9）迁移率变动分析（Mobility Shift Assay）检测
当 ATP 浓度接近其 Km 值（如 50 µmol/L）时，ATPase 活性引起的水解可导致 ATP 耗竭，使特异性活性信号趋于平台。在此条件下，随激酶浓度升高，底物磷酸化反而无法被检出。因此，必须将酶浓度调整至不造成信号饱和的范围，方能准确测定激酶活性。

对于考虑使用 Carna 提供的 ADP-Glo™ 检测试剂盒或 ADP-Glo™ 激酶检测服务的用户

关于 Carna 提供的 ADP-Glo™ 产品和服务的详细信息，请参阅下方链接的专属页面。如有任何关于产品或服务的咨询，请随时与我们联系。

ADP-Glo™ Profiling Assay Services

ADP-Glo™ Assay Kits