カルナバイオサイエンス株式会社

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カイネティクス測定キナーゼ
アッセイキット PhosphoSens™

Mg2+をキレーティングすることで蛍光を発する(Chelation-enhanced fluorescence:CHEF)Sulfonamido-Oxine(Sox) をペプチドなどの基質に結合させ、キナーゼによる基質のリン酸化を蛍光強度の増加として経時的に検出することを可能にした技術がPhosphoSens™ です。この技術を用いることにより、ホモジニアスなアッセイ系で簡便にダイレクトなカイネティックス測定が可能となりました。PhosphoSens™ 技術を用いて既にアッセイが構築されているターゲットを全てお使いやすいキット製品としてご提供中です。

キットに含まれている試薬は全て最適化されており、お客様は試薬を混合して測定するだけ。リン酸化および脱リン酸化状態の変化をリアルタイムにモニターできるため、様々なパラメーター解析が可能、Km, Vmax, kcat, IC50, Kinact/KI, Ki, Kon, Koff, Residence Time 等々ご要望に合わせて幅広いデータを取得頂けます。また、エンドポイントでの測定を可能にするPhosphosens™ REDにも対応しております。キットのご使用にご満足頂ければ、追加でPhosphoSens™ 基質をはじめ別売りの試薬をご購入頂く事でお客様サイドでアッセイをスケールアップして頂けます。

PhosphoSens™技術とは?

[ アッセイ原理 ]
PhosphoSens™ ではSoxをシステイン残基に導入した改良型CSoxセンサーを使用。CSoxを結合させた基質がキナーゼ、ATP、Mg2+の存在下でリン酸化されるとMg2+がリン酸基とCSoxにキレーティングされることにより複合体が形成される。ここに励起光を照射することで蛍光を発する。この蛍光強度の変化を経時的に検出することで、基質のリン酸化状態の変化をリアルタイムでモニターすることが出来る。
(本技術はマサチューセッツ工科大学(MIT)にて開発、MITが保持する特許を独占的にAssayQuant社が実施)

<PhosphoSens™ RED>
ハイスループットな試験をご希望なら、エンドポイントでの測定が可能なPhosphosens™ REDがお勧めです。
反応系にEuropiumを添加することで、Mgの配位を置換して360nmの励起で616-620nmの赤色域の蛍光を発するcomplexが形成されます。complexが発する赤色光を時間分解蛍光測定(100-200 μ seconds delay)で検出することにより、青~緑色領域で強くみられる化合物の自家蛍光などのバックグラウンドの蛍光を排除し、エンドポイントでの測定を可能にしました。

通常のPhosphosens™ カイネティクス測定と同一の基質をPhosphosens™ REDによるエンドポイントでの測定に用いた場合は、HTSからSARやMOAの解析までをシームレスに実施頂くことが可能です。

測定ステップ

測定ステップ
キナーゼキット内容
CSox調整済み基質(PhosphoSens™)
ATP
DTT
リアクションバッファー
希釈バッファー
プロトコール
Europium 溶液 (Phosphosens™ REDご希望時のみ)

キナーゼは別売りとなっており、当社で販売中のキナーゼ製品をお求めの場合はキットと合わせてお届け可能です。

お使い頂けるプレートサイズ
96-well  384-well  1536-well
測定装置として多様なマイクロプレートリーダーで測定可能
Excitation;360nm、Emission;485nmでの測定が可能な装置なら
何でもOK!
別売り試薬
CSox調整済み基質(PhosphoSens™)
キナーゼリアクションバッファー (x10) (10mL)
キナーゼ希釈バッファー (x1) (5mL)
細胞溶解バッファー(x10) (10mL)
ATP (x100) (100mM, 1mL)
DTT (x1000) (1000mM, 1mL)