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F.A.Q.

キナーゼ蛋白質

プロファイリングサービス

アッセイキット/アッセイ開発

結晶化サービス

タンパク質間相互作用のセルベースアッセイ

その他

NanoBRET™ TE Intracellular Kinase セルベースアッセイサービス

キナーゼ蛋白質

Q製品の包装容量を教えて下さい。
A

最少5ug から 100, 200, 500, 1000ugで販売しております。一部、少量品(5ug)のみ対応の製品がございます。Inactive, Inactive-mutant 品は50ugです。1mgを超えるバルク販売にも対応しております。

Qリストにないキナーゼ蛋白質が欲しいのですが。
A

弊社までお問合せ下さい。開発段階にあるもので、ご要望により優先順位を上げる場合もございます。また、お客様のご希望により変異体作製も可能です。

Qキナーゼ蛋白質の由来を教えて下さい。
A

全てリコンビナントヒト蛋白質です。

Qキナーゼ蛋白質の製造方法について教えて下さい。
A

キナーゼ蛋白質の大部分はバキュロウイルス発現系を用いて製造しておりますが、一部の製品は大腸菌発現系を用いて製造しております。各蛋白質製品の製造方法の概要については、弊社キナーゼ蛋白質製品ページの「Product Name」をクリックして、Product Informationを開いていただき、「Product description」にてご覧いただけます。

Qキナーゼ蛋白質を活性化処理されていますか?
A

活性が低い又は初期反応にラグのあるキナーゼ蛋白質に対して高い活性を得るためにATP処理、上流キナーゼとの共発現又はインキュベーション、プロテアーゼによるGSTタグの除去などキナーゼの性質に合わせて活性化処理を実施しています。弊社のテクニカルノート「Carna Coffee Break No.1」にて詳しくご紹介させていただいておりますので、是非ご参照下さい。

Q不活性キナーゼ蛋白質を購入できますか?
A

MAPキナーゼカスケードに関連する不活性キナーゼ及び不活性変異キナーゼを販売しております。これらは基質としても利用することができます。弊社キナーゼ蛋白質製品ページをご覧下さい。

Qキナーゼ蛋白質のタグを切断できますか?
A

全てのキナーゼ蛋白質製品にはキナーゼ蛋白質とタグとの間に切断サイトが含まれております。GSTタグはPrecission protease (Cytiva) を用いて切断できます。HisタグはTEV proteaseを用いて切断できます。ビオチン化製品につきましては、キナーゼ蛋白質とビオチン化部位との間にDYKDDDDKタグが含まれておりますので、enterokinaseを用いてビオチン化部位を切断できます。

Qビオチン化キナーゼ蛋白質にはいくつのビオチンを含んでいますか?
A

1キナーゼ蛋白質に対して1つのビオチンを含んでいます。

Qキナーゼ蛋白質の品質をどのように確認していますか?
A

SDS-PAGEによって純度を決めます。さらに基質に対するリン酸化を調べて、活性を確認しています。

Q製造バッチが変わった場合の活性が気になります。
A

再現性の高い製造法を用いておりますので、ほとんどの製品に於いてバッチ間差は非常に小さいですが、バッチ間の活性や純度の違いのご確認をご希望される場合は、弊社までお問い合わせ下さい。

Q製造したキナーゼ蛋白質が目的とするキナーゼ蛋白質であることをどのように確認しますか?
A

質量分析法にてペプチドマスフィンガープリンティングを実施し、アミノ酸配列が正しいことを確認しております。

Qキナーゼ蛋白質の配列情報を確認できますか?
A

弊社キナーゼ蛋白質製品ページの「Product Name」をクリックして、各製品のProduct Informationを開いていただき、ページ上部にある「AMINO ACID SEQUENCE」からご覧いただけます。

Q結合試験にはどの製品が適していますか?
A

純度が高く、ラベルの分子量が小さなビオチン化キナーゼ蛋白質をお勧め致します。

Q法規制の対象でしょうか?
A

弊社のキナーゼ蛋白質は全て安全データシートの対象外ですが、多くの製品がカルタヘナ法に該当致します。各製品のカルタヘナ法への該当状況のご確認をご希望の場合は、弊社にお問い合わせ下さい。

Qどこで製造されているのでしょうか?
A

全製品、カルナバイオサイエンス社内のラボで製造しております。

Qどの様な形態で届けられるのでしょうか?
A

ドライアイス便での凍結状態でお届けいたします。お受け取り後は速やかに-80℃での保管が可能な冷凍庫に移動させて下さい。使用期限まで品質を保つには適切な保管が不可欠です。キナーゼ蛋白質を解凍しましたら、残余液は凍結融解の繰り返しを避けるため、分注して下さい。

Q納期について教えて下さい。
A

ご希望の製品が在庫にある場合はご注文後約1週間以内にお届け致します。在庫状況のご確認をご希望の場合は、弊社にお問い合わせ下さい。

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プロファイリングサービス

QKm値付近のATP濃度で測定する理由は何ですか?
A

ATP拮抗型阻害剤の場合、50%阻害濃度 (IC50)とATP濃度の関係は、Cheng-Prusoffの式 (IC50 = Ki + Ki/Km×[ATP])と表され、ATP濃度にKm値を用いると、IC50=2Kiとなり、キナーゼと阻害剤の親和性に基づいて、全てのキナーゼに対するIC50を比較評価することが可能になります。

Qアッセイにかかる費用を知りたいのですが。
A

こちらのフォームにてお問合せ下さい。被験物質数、ご選択されるキナーゼ数、濃度数をお知らせ下さい。なお、アッセイは基本的にduplicateで行ないます。

Qアッセイ濃度の設定について教えて下さい。
A

先ずは1〜10μMでの%阻害率を測定し、阻害活性が強かった化合物に対して%阻害率の結果を参考に濃度設定をし、IC50を測定することをお勧めしております。

Qアッセイ系や基質等の詳しい状況は確認出来ますか?
A

キナーゼプロファイリングブックにはアッセイに使用する各キナーゼの詳細やアッセイ条件等が詳細に記載されています。是非ダウンロードの上、ご利用下さい。

Q被験物質はどのように準備すればよいですか。
A

原則、試験トップ濃度の100 倍濃度のDMSO 溶液にて、100キナーゼまでは500uL、100キナーゼ 以上は1000uL ご準備下さい。詳細はこちらのサイトをご参照下さい。

Q試験を終了した化合物を別試験に使用するため、保管することは可能ですか?
A

可能です。お預かりしている化合物は、試験結果報告書提出日の3ヶ月後に廃棄させて頂いておりますので、その間であれば保管させていただいております。保管の延長をご希望される際には、ご相談ください。

Q測定方法の使い分けについて教えて下さい。
A

MSA法が、操作がシンプルであり、再現性が高く、リン酸化及び非リン酸化基質の両方を同時に検出できる点から、弊社ではMSA法を第一に選択しております。しかしながら、MSA法で使用できる基質は、配列中に含まれるリン酸化部位が1か所であること、またpIが中性付近のペプチドに限られているため、そのような基質が見つからない場合は別の方法でプロファイリング試験をしています。例外はございますが、基本的には基質が脂質であるものはADP-Glo™法、ペプチド基質に2箇所以上のリン酸化が生じるものはIMAP法を使っております。

Q1mMのATP濃度で測定する利点は何ですか?
A

1mM ATPプロファイリング試験は生理的ATP濃度に近い条件を使用して、阻害剤の、細胞内における潜在的な選択性を予測することに役立ちます。また、Km値のATP濃度でのIC50と比較し、ATP非拮抗型阻害剤の可能性を予測することにも役立ちます。

Q何種のキナーゼ蛋白質がアッセイ可能ですか?
A

現在342のキナーゼ蛋白質に対するアッセイが可能で、随時更新しております。お客様のご要望に応じ、1キナーゼからご選択いただけます。

Qアッセイを依頼したいのですが、どのように申し込めばよいですか?
A

サービスのご提供に際し、お客様と秘密保持契約書、及び委受託契約書の締結が必要です。締結後、申込書をダウンロード、記入の上、メールにてご提示下さい。

Q試験期間はどのくらいですか?
A

通常約2-3週間で試験結果報告書をパスワード付きのPDFファイルでお送りしています。アッセイは被験物質受領後の月曜日に開始します。

Q"preincubation"の試験ではどのような操作が加わるのでしょうか?
A

このサービスでは、標準的なMSA法で活性を測定する前に、試験化合物とキナーゼを室温で30分間のプレインキュベーションを行います。これは、結合速度が遅い化合物の効力を評価することに役立ちます。

Qパネルアッセイはありますか?
A

現在、特徴ある4種類のパネルをご用意しております。TK, STKパネルの組み合わせにお客様任意で数種のキナーゼ追加、というようなカスタムも可能です。

QATP濃度に記載されている「bin」とは何ですか?
A

弊社では、ATP濃度にKm値を選択したプロファイリング試験において、キナーゼ毎に測定及び算出しましたKm値を区間(bins)に分類し、区間毎にきりのよいATP濃度を設定しております。そのため、ATP試験濃度を「Km bin」として表記しております。例えば、キナーゼのATPのKm値が47μMの場合、同様のATP Km値を持つ他のキナーゼと共にグループ化され、50μM ATPで実行されます。これにより、各キナーゼアッセイがKm値に非常に近いATP濃度で確実に実行され、また同時に多数のキナーゼアッセイを効率的に行うことを可能にします。

Qリファレンス化合物は何を使用していますか?
A

大部分のキナーゼアッセイにstaurosporineを使用しており、可能な場合はキナーゼ特異的な阻害剤を導入しております。弊社プロファイリングサービスページの対象キナーゼをクリックしていただくと、該当キナーゼアッセイに使用されているリファレンス化合物をご参照いただけます。

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アッセイキット/アッセイ開発

QIMAPTM ビーズは別途購入出来ますか?
A

カルナではIMAPTM ビーズを別途販売しております。

Q付属するプロトコルを事前にみることは出来ますか?
A

こちらのサイトから各プラットフォームのプロコトルをダウンロードの上、ご参照いただけます。

Q構成品を単品で購入することは出来ますか?
A

当該キットををご購入いただいたお客様に限り対応が可能です。ご了承下さい。

Q納期はどのくらいですか?
A

カスタムメイド品ですので、ご発注後、通常約2-3週間お届けが可能です。

Qアッセイ開発キットを使用するにあたり、他に準備しておくものはありますか?
A

IMAPTM 、ELISA、TR-FRETキットにおいてはお客様で別途ご用意いただくものがございます。各プロトコルの1ページ目に試薬名、必要量等、詳しい記載がございますのでご参照下さい。

Qプレートはどこのメーカのものを用意すればいいですか?
A

プロトコルに推奨するプレートのメーカ名、型番の記載がございますのでご参照下さい。

Qアッセイ開発キットの構成品について教えて下さい。
A

各プラットフォームにより異なります。詳細はこちらのサイトをご参照下さい。

Qアッセイ開発キットの販売最小単位を教えて下さい。
A

ELISAキットのみ100dp/セット、他は400dp/セットとなっております。

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結晶化サービス

Q結晶化グレード蛋白質の詳細な情報(シークエンス等)を教えて下さい。
A

開示できる範囲でご提示いたします。こちらのフォームにてお問合せ下さい。

Q結晶化グレード蛋白質の販売容量を教えて下さい。
A

ご希望の結晶化グレード蛋白質容量につきましてはご相談に応じます。
お気軽にお問合せ下さい。

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タンパク質間相互作用のセルベースアッセイ

Q他のタンパク質間相互作用にも応用が可能でしょうか?
A

GPCRのみならず、FKBP-FRBの相互作用など細胞質内の遊離タンパク質の相互作用検出にも実績があります。タンパク質間相互作用によりSplit Luciferaseが発光するかどうかは,タンパク質の構造安定性,細胞内での発現量,相互作用した時のルシフェラーゼフラグメントの近接の程度など,様々な要素に依存しています。本技術を用いてタンパク質間相互作用のアッセイ系を構築したい場合は,先ずは弊社にお問い合わせ下さい。

Q基質は何を用いたら良いでしょうか?
A

Split Luciferase Assay用に開発された弊社製品Split Glow Cell Assay Reagent (PXR-SG001)の使用をお勧めします。 本アッセイ用に最適化された溶液組成となっており,最大の発光シグナルを得ることができます。なお細胞を溶解せずに生細胞のままで発光検出する場合は、PBSまたはHBSSに市販のD-Luciferinを溶解(1.0 mM程度)してご使用ください。

Q測定方法はどのような装置を用いればよいでしょうか?
A

市販の発光検出用プレートリーダーまたはチューブタイプルミノメーターをご使用いただけます。できるだけ高感度の検出装置のご使用をお勧め致します。

Q他のルシフェラーゼを用いた類似技術と較べた時の有意点は何ですか?
A

弊社のスプリットルシフェラーゼシステムに用いているエメラルドルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼに比べて細胞内での安定性が増しており,発光強度が約15倍明るい特性を有しています。さらに、バックグラウンド発光を低く抑えることができる専用基質Split Glow Cell Assay Reagent (PXR-SG001)を用いることで,刺激応答によるタンパク質感相互作用を高感度で検出することができます。 またGPCRスクリーニング用細胞では、リガンド刺激後わずか10分程度で発光検出することができるため、薬物のハイスループットスクリーニング系として非常に有用です。さらに生細胞イメージングや小動物を用いたイメージングにもスプリットルシフェラーゼ技術は応用可能であるため,スクリーニングした化合物を生細胞や小動物で評価する上でも非常に有効です。

Qイメージングにも応用できますか?
A

弊社のスプリットルシフェラーゼシステムに用いているエメラルドルシフェラーゼは発光強度が極めて強いため,単一細胞レベルでリアルタイムに発光を長時間モニターすることが可能です。GPCRとarrestinとの相互作用のイメージングデータは,弊社のHPでも御覧頂くことが可能です。生細胞での発光検出となるため、基質はD-Luciferin を培地に希釈してご使用ください。実験条件などの詳細については弊社にお問い合わせください。

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その他

Q支払期限を教えて下さい。
A

弊社と直接お取り引きの場合は月末締めの翌月末払いとさせていただいております。

Qキナーゼ蛋白質、アッセイ開発キットを購入したいのですが、代理店はありますか?
A

お客様が所属の企業、団体で特に指定の代理店がない場合は、弊社より販売代理店をご紹介いたします。お問合せ下さい。

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NanoBRET™ TE Intracellular Kinase セルベースアッセイサービス

Q試験で使用するトレーサーを顧客側で指定できるでしょうか?
A

お客様ご指定のトレーサーを用いて試験を実施することは可能ですが、弊社でバリデートしたトレーサーとは異なるため、試験結果の妥当性について保証することが出来ません。

Q事前に使用するトレーサーの種類がわかりますか?
A

弊社では、原則、プロメガ社推奨のトレーサーを使用して試験を行っておりますが、社内検討により一部プロメガ社とは異なるトレーサーを使用している試験がありますので、弊社までお問い合わせください。またプロメガ社のウェブサイトに掲載されていないキナーゼにつきましても、トレーサーの種類をご回答申し上げます。なお試験報告書には使用したトレーサーの種類を記載致します。

QResidence time測定におけるトレーサーの濃度を教えて下さい。
A

原則、IC50測定系のトレーサー濃度が1 µmol/Lを超える場合はトレーサー濃度を2 µmol/Lとし、それ以外は1 µmol/Lとしております。

Q事前にリファレンス化合物名を教えてもらえるでしょうか?
A

可能です。弊社にお問い合わせください。

Qターゲットリストに無いキナーゼのアッセイの対応は可能でしょうか?
A

弊社までご相談下さい。

Q事前にNanoLuc® 融合キナーゼの構造について教えてもらえるのでしょうか?
A

キナーゼのN末端もしくはC末端にNanoLuc®を融合した構造となります。上記に掲載のプロメガ社ウェブサイトのベクター名においてNanoLuc®がキナーゼ名の前に記載されている場合はN末端、キナーゼ名の後ろに記載されている場合はC末端に融合しています。プロメガ社のウェブサイトに掲載されていないキナーゼにつきましては、弊社までお問い合わせください。なお試験報告書にはベクター名を記載致します。

QResidence time測定において、IC80-90の化合物濃度を推奨される理由は?
A

化合物のキナーゼに対する占有率が100%である状態から、結合していない残存化合物を除去し、結合化合物のキナーゼからの解離過程を評価することが理想的です。しかし一方、化合物濃度が高すぎると結合していない残存化合物の完全な除去が難しく、この残存化合物のキナーゼへの再会合が試験結果に影響します。このため最適な濃度としてIC80-90の濃度で試験を行うことをお勧めしています。

Q報告書、試験データの一例を見せてもらうことは出来ますか?
A

可能です。弊社にお問い合わせください。

Q化合物の IC50測定、阻害率測定の試験で使用するトレーサーの濃度は?
A

上記のプロメガ社ウェブサイトに掲載されているキナーゼリストのアプリケーションノートに記載のトレーサー濃度で試験を行っておりますが、社内検討により一部プロメガ社とは異なるトレーサーを使用している試験がありますので、弊社にお問い合わせください(原則、トレーサーの濃度反応曲線のEC50付近。上限は2 µmol/L)。またプロメガ社のウェブサイトに掲載されていないキナーゼにつきましても、トレーサーの濃度をご回答申し上げます。

QBRET ratioはどのように計算して求められるのでしょうか?
A

BRET ratioは、ドナーシグナル(NanoLuc® 融合キナーゼ)及びアクセプターシグナル(トレーサー)を用いて、以下の式で計算されます。

    BRET ratio (mBRET)

    = {(Acceptor_sample/Donor_sample) – (Acceptor_no tracer/Donor_no tracer)}×1000

    Acceptor_sample: トレーサー存在下におけるサンプルもしくはDMSOコントロールのアクセプターシグナル
    Donor_sample: トレーサー存在下におけるサンプルもしくはDMSOコントロールのドナーシグナル
    Acceptor_no tracer: トレーサー非存在下におけるDMSOコントロールのアクセプターシグナル
    Donor_no tracer: トレーサー非存在下におけるDMSOコントロールのドナーシグナル

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その他のご質問はこちらのサイトからお問い合わせ下さい。

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